鹽酸吉西他濱為核苷同系物,屬細胞周期特異性抗腫瘤藥。主要殺傷處于S期(DNA合成)的細胞,同時也阻斷細胞增殖由G1向S期過渡的進程。本品在細胞內由核苷激酶代謝成有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)和三磷酸核苷(dFdCTP)。其細胞毒活性就來源于這兩種核苷抑制DNA合成的聯合作用。二磷酸吉西他濱可抑制核糖核苷酸還原酶,而該酶催化DNA合成過程中生成三磷酸脫氧核苷的化學反應。從而導致脫氧核苷酸(包括dCTP)的濃度降低,三磷酸吉西他濱可與dCTP競爭性結合到DNA上,而細胞中dCTP濃度的降低(由其二磷酸鹽的作用而產生)可促進三磷酸吉西他濱與DNA的結合,結果一個核苷酸摻入到合成過程中的DNA鏈上,從而阻止DNA的進一步合成。另外,DNA聚合酶ε并不能夠清除吉西他濱核苷酸和修復合成過程中的該DNA鏈。